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核酸酶P1

作者: luobin           点击数: 55           发表时间: 2014-12-30 10:45:00

核酸酶P1是一种含锌的金属酶,能够水解RNA和热变性DNA得到5'-核苷酸,广泛运用于核苷酸工业生产中,是具有重要应用价值的酶制剂。目前随着在婴幼儿奶粉及保健品领域的广泛应用,核苷酸市场变得越来越大。

        核酸酶P1(Nuclease P1,EC3.1.30.1),又名5'-磷酸二酯酶,是一种含锌的金属酶,核酸酶P1能够水解RNA和热变性DNA得到5'-核苷酸,广泛运用于核苷酸工业生产中,是具有重要应用价值的酶制剂。核苷酸是生物体内重要的低分子化合物,具有许多生理功能,目前,随着在婴幼儿奶粉及保健品领域的广泛应用,核苷酸市场变得越来越大。核酸酶P1在核苷酸工业化生产中起着至关重要的作用。

一、核酸酶P1的性质

1、分子结构

      核酸酶P1的分子量约为44KD,由331个氨基酸多肽单链构成,含有2个二硫键,并含有3个锌原子,酶分子含17.4%的碳水化合物。核酸酶P1的活性中心存在的一个三锌结构,Zn1~Zn3大约相距0.32 nm,Zn2~Zn1相距0.58 nm,Zn2~Zn3相距0.47 nm;两个水分子(W2和W3)吸附在Zn2上,一个水分子(W1)搭桥于Zn1和Zn3之间。研究认为W2在催化过程中可能起亲核试剂的作用。C.Romier等人利用底物结构类似物结合核酸酶,获得高分辨率的核酸酶x-射线晶体(0.18 nm)。其结构分析表明,核酸酶P1有两个口袋样的结构,可能是两个对单核苷酸的吸附或识别位点。其中一个位点(Phe位点)靠近三锌活性中心,主要是依靠Phe61和腺苷酸之间的相互作用。在这个吸附位点底部,Asp63的羧基可能与腺苷酸的N1以及6-NH2形成氢键。第二个识别位点为Tyr位点,在这个位点中,腺苷酸象三明治一样被夹在Tyr144和Tyr155之间,位点底部的Asp146和腺苷酸可能形成氢键。三锌活性中心处于其中一种口袋模样结构的附近,由于该结构只允许单链的RNA或DNA进入,所以核酸酶P1只能催化单链的核酸。研究还表明,每个识别结构底部的Asp与腺苷酸形成的氢键可能与核酸酶P1的最适pH值有关,即pH值的大小直接与氢键形成的多少以及牢固程度有关系。根据分子结构推测核酸酶P1的催化机理可能为:在Zn1和Zn3之间水分子的-OH经过Asp45激活后攻击单链核酸的P-O3′键,从而与O3R′发生亲核取代,Zn2对劈分下来的O3′起到稳定作用,多余的负电荷则被Arg48中和。

2、温度和pH的影响

    核酸酶P1的温度适用范围比较广,是一种热稳定酶,在45-95℃均有催化活性。其最适酶反应温度为68℃。最适pH因底物而异,一般在pH5-8都有较强的活性。核酸酶P1的最适pH还与溶液中的离子种类和离子强度有关。对于酵母核酸而言,此酶的最合适pH为5.0左右。

3、金属离子的影响

   金属离子对核酸酶P1催化活性的也有较大影响,在一定的浓度范围内,锌离子有明显的激活作用。因为核酸酶P1是一个具有水解核酸功能的含锌的金属酶,酶蛋白分子中含有3个的锌离子。锌离子不但维持着酶蛋白分子空间结构,而且参与了酶解核酸的反应,是核酸酶P1活性中心的重要组成部分。而铜离子具有明显的抑制作用。铜离子对核酸酶P1抑制作用机制目前尚不清楚,可能是铜离子作用于核酸酶P1本身,使之构象发生变化而降低酶活力,或是铜离子与RNA结合,使之无法与核酸酶P1完全结合而起抑制作用。真正的抑制作用原因还有待于进一步研究。因此核苷酸生产过程中应当避免接触含铜的化合物。 

4、催化特性

    核酸酶P1是一种磷酸二酯酶,只切割单链DNA或RNA,而对碱基对没有特异性。实际上,该酶具有两种酶的活性,一是磷酸二酯酶活性,作用于RNA或DNA单链中的3', 5'--磷酸二酯键,生成5'-核苷酸;二是3'-磷酸单酯酶活性,分解单核苷酸或寡聚核苷酸中的3′-磷酸单酯键。但是也有报道低浓度核酸酶对某些核苷酸序列有一定的嗜好性。影响核酸酶P1催化活性的因素很多,主要有温度、pH值、金属离子和一些有机试剂。总的来说,核酸酶P1的温度适用范围比较广,是一种热稳定酶,在45℃~75℃都有催化活性,这种热稳定性可能与酶蛋白中存在有较多的疏水性氨基酸有关。其最适酶反应温度为70℃,但若要长时间作用,在60℃以下可能更为适合。有报道在pH值5.3,67℃条件下作用15 min,酶活还能保持在50%以上。核酸酶P1的最适pH值因底物而异,一般在pH值5~8都有较强的活性。而且,核酸酶的最适pH值还与溶液中的离子种类和离子强度有关。对于酵母核酸而言,此酶的最合适pH值为5.0。

    核酸酶P1是一种锌酶。在酶蛋白中,Zn的含量和状态很重要,Zn易被其它的二价离子置换,并在一定程度上会影响到酶的结构和活性。活性中心的三锌结构中Zn3比较容易被铜离子取代,这一置换并不影响酶与底物的亲和力,但是对于酶的活性可能有较大的影响。研究发现,Cu(Ⅱ)的掺入大大降低了酶的活性,而且锌离子被铜离子所置换量的多少与核酸酶P1所处环境的pH值有很大的关系。此外其他二价金属离子对核酸酶P1的活性也有一定的影响,钙离子、镁离子可能有促进作用,而高浓度的锰离子、铅离子则有抑制作用。核酸酶P1在盐酸胍和SDS等变性剂存在的条件下容易变性而失活,但是盐酸胍和尿素对核酸酶的作用是可逆的。核酸酶P1在有机溶剂中比较稳定,甲基酰氨、二甲亚砜存在时仍有较高的酶活。

二、生产方法和应用

   1、生产方法

      核酸酶P1的生产方法主要有3种:固体发酵法、深层液态发酵法以及固定化液体发酵法。固体发酵(solid-state fermentation,SSF)操作简单,成本低,利用麸皮等农作物为原料,也能够得到较高酶活的粗酶液。但是由于这些农产品成分非常复杂,因而,要想获得纯的核酸酶P1较为困难和繁琐。

     深层液态发酵法利用现代发酵技术,通过装在发酵罐中的各种感应器,可以较好的控制发酵过程,其原料的配比也比较明确。通常的液体发酵主要工艺条件为:合成液体培养基,通风1∶0.4,发酵温度30℃,培养时间为50~70 h。不同生产厂家的工艺条件依据本身使用的菌种和设备有所调整。总体来说,液态发酵的菌丝体和发酵液较易分离,是目前国内外生产核酸酶P1粗酶液的主要方法,广泛运用于核苷酸发酵中。

    近年来固定化液体发酵法在国外快速发展,将菌丝体固定在谷梗或其他一些惰性的材料上,重复使用,既提高了细胞的利用率和生物反应速率,也便于产物的分离。特别是利用某些惰性材料作为载体,可以在保持酶活的同时,简化发酵液的成分,便于核酸酶的提取和纯化。

 2、应用领域

     核苷酸类物质的最早应用是5'-肌苷酸呈鲜味性质的发现。但后期均未做呈味方面的深入研究。1960年,日本科学家发表了关于5'-肌苷酸具有强烈鲜味的文章,日本首先将核苷酸类物质作为鲜味剂生产,并于60年代后期成为核苷酸类物质的最大生产国。70年代以来,核苷酸类物质及其衍生物的应用己远远超出调味增鲜作用,特别是在抗病毒和抗癌瘤作用方面,受到医药界的重视。

2.1 食品方面的应用

2.1.1 调味品

    许多核苷酸类物质都有强化食品风味的功能。研究发现5'-鸟苷酸钠比5'-肌苷酸钠要鲜3~4倍,同时还发现氨基酸类型与核苷酸类型的鲜味剂混合使用时其鲜味特性有相乘的增味效果即协同效应。5'-鸟苷酸和5'-肌苷酸与味精可以配成一种将动植物鲜味融于一体的增味剂,鲜味强度大大提高,按1:1混合的MSG~IMP产生的味觉强度比单独用MSG增强30倍,且MSG与IMP的协同效应在1:1时是

最明显的,但由于MSG和IMP的生产成本很高,现在工业上生产的特鲜味精的比例通常是MSG:IMP:GMP为95:25:25,可产生味觉强度增强近6倍的协同效应。

2.1.2 对婴幼儿的营养作用

    核苷酸在生物体内有重要的生理生化功能,哺乳动物的许多生长代谢旺盛的组织合成核苷酸的能力缺乏或有限,必须利用预先形式的核苷酸,以维持其分裂、生长及发挥特殊功能的器官。新生儿出生时免疫系统相对不成熟,早期淋巴器官迅速成熟增大,淋巴细胞在活化时需要更多的外源性核苷酸。体内合成的核苷酸不能满足这些重要组织生长的需要,而可被利用的核苷酸及其衍生物在人乳中含量很丰富,代乳品中含量却很低。Uauy表明 将核苷酸添加到以牛奶为基础的代乳品中,对婴幼儿的胃肠道发育、胃肠道健康的维持以及血浆脂蛋白的组成都有有利的影响。Brunser研究结果表明外源核苷酸能减少婴儿腹泻的发生。

2.1.3 营养保健的应用

    核苷酸营养的作用机制是通过改善细胞活力而提高机体各系统的自身功能和自我调节能力,达到最佳综合状态和生理平衡,具有广泛而稳定的营养保健作用。人体中从最初的核苷酸开始进行核酸合成的有肝、肾,大部分在肝脏进行。人进入中年以后,肝脏的合成能力逐渐减退。核苷酸添加于营养保健品中,对促进儿童的生长发育,增强智力,提高成年人的抗病抗衰老能力及手术病人的身体康复均有显著作用,特别是对老年人效果更为明显。

2.2 医药方面的应用

核苷酸类物质及其衍生物的应用已经远远超出了食品工业领域,特别是在抗肿瘤、抗病毒等方面的特有疗效使得其在医药工业上的应用越来越受到重视。研究表明,核苷酸及其降解物、衍生物有良好的治疗作用,其组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有较好的抗肿瘤作用,阻断蛋白质、核酸的生物合成,抑制癌细胞的增殖,腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、胞二磷胆碱、核苷三磷酸等核酸的有关组分及衍生物,是天然的代谢激活剂,有助于改善机体的物质代谢和能量代谢,加速受损组织的修复,促使病态细胞、缺氧组织恢复正常生理功能。临床广泛用于放射病、血小板减少、急慢性肝炎、白细胞减少、心血管疾病等。核苷酸及其衍生物自身可以作为药物,同时还可作为生产其它核酸类药物的重要医药中间体。在核苷酸的衍生物中,还有一类非常重要的寡聚核苷酸一即反义寡聚核苷酸,其独特价值尤其令医药界瞩目,为从细胞水平上的治疗提供了相应的载体和药物。与传统医药技术相比较,核苷酸及其衍生物有独特专一性,高效性以及很小的毒性等优势,治疗效果受到肯定。核苷酸类药物有望成为2l世纪解决疑难杂症的新型药物和方法。

2.3 农业方面的应用

    腺苷酸可被用作植物的生物激素,通过对多种作物进行对比实验,己取得不同的增产早熟效果;核酸的衍生物可作为防止植物病虫害的药物,有望发展成为新一代无毒高效农药。

2.4 其他方面的应用

   在动物饲料领域中关于核苷酸的研究报道了核苷酸在动物日粮中添加核苷酸可促进其生长和提高饲料利用率和改善肉质的作用;另外核苷酸有促进蛋白质合成作用,具有防皱、保湿、抗衰老等功能,核苷酸制品在化妆行业应用广泛。 

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